luty 2024

Telomery w procesie starzenia

Blog naukowy -portal wiedzy / By Łukasz Sobkowiak / 28 lutego, 2024

Od momentu pierwszych odkryć dotyczących mechanizmu replikacji DNA biologowie poczynili wiele starań zmierzających do szczegółowego opisania tego fenomenu. Obecnie znanych jest przynajmniej 13 różnych polimeraz DNA, które są wyspecjalizowane w wybranych aspektach syntezy i naprawy DNA. Oprócz białek o aktywności helikazy i topoizomerazy odkryto dodatkowe elementy maszynerii replikacyjnej takie jak: prymaza, która jest odpowiedzialna za syntezę krótkich fragmentów kwasu nukleinowego na początku replikacji, białko SSB stabilizujące strukturę DNA w tym procesie, ligaza, która łączy zreplikowane fragmenty DNA. Zwróć uwagę, że DNA ma strukturę antyrównoległą, natomiast polimeraza DNA ma zdolność syntezy tylko w jednym kierunku od końca 5’ do końca 3’. W obecnym modelu replikacji jedną z nici określa się mianem nici prowadzącej, druga z nici nazywana jest nicią opóźnioną. Antyrównoległość helisy wymusza istotne różnice w procesie syntezy nowego DNA na każdej z tych nici. Replikacja na nici prowadzącej przebiega w sposób ciągły, natomiast druga nić kopiowana jest krótkimi fragmentami, które od nazwiska japońskiego odkrywcy tego skokowego mechanizmu syntezy zostały nazwane fragmentami Okazaki. Co ciekawe, liniowe końce chromosomów przy każdej rundzie replikacji ulegają niewielkiemu skróceniu, które jest wynikiem różnic w syntezie nici prowadzącej i opóźnionej. Takie skracanie materiału genetycznego prowadzi ostatecznie do ograniczenia możliwości replikacji starzejących się komórek. W 1962 roku Leonard Hyflick zaobserwował, że komórka przechodzi jedynie ograniczoną ilość podziałów, po czym traci tę zdolność – punkt, w którym komórki tracą możliwość dalszych podziałów nazywany jest limitem Hyflicka.

Obecnie uważa się, że zatrzymanie podziałów związane jest bezpośrednio ze skracaniem się chromosomów w trakcie kolejnych rund replikacji i zabezpiecza organizm przed niebezpieczną utratą materiału genetycznego. W trakcie ewolucji komórki wypracowały jednak mechanizm przeciwdziałania skracaniu się chromosomów poprzez dodawanie do ich końców tzw. telomerów, które są zbudowane z wielu powtórzeń stałej sekwencji kilku nukleotydów – sekwencja ta została zakonserwowana ewolucyjnie od drożdży, poprzez orzęski, po rośliny wyższe i ssaki. Telomery człowieka są dobudowywane przez kompleks rybonukleoproteinowy (składa się z białka oraz kwasu rybonukleinowego) nazywany telomerazą i składają się z kilku tysięcy powtórzeń sekwencji TTAGGG. Telomeraza znalazła się w szczególnym polu uwagi biologów molekularnych z racji tego, że zaburzenia jej funkcjonowania mają swoje implikacje w procesach starzenia oraz w nowotworzeniu. Większość somatycznych komórek człowieka wytwarza zbyt mało telomerazy, aby utrzymać prawidłową długość telomerów po wielu cyklach replikacji chromosomów, a utrata telomerów może doprowadzać do niebezpiecznej fuzji końców chromosomów, wzmaga procesy związane ze zmiennością rekombinacyjną i prowadzi do uruchomienia apoptozy czyli programowanej śmierci komórki.

Z kolei komórki nowotworowe charakteryzują się wzmożoną aktywnością telomerazy, co w połączeniu z deregulacją cyklu komórkowego, pozwala im na niekontrolowaną proliferację. Podczas starzenia się organizmu dochodzi w komórkach do zmian struktury oraz do zaburzeń funkcji telomerów człowieka, co ma z kolei istotne implikacje dla stanu zdrowia. Niestabilność genomu spowodowana skracaniem się sekwencji telomerowych, z których w każdej rundzie replikacji znika około 50 – 150 pz, przyczynia się częstszego występowania nowotworów.

Dyskeratoza wrodzona recesywna, związana z chromosomem X oraz dyskeratoza wrodzona, dominująca, autosomalna to znane medycynie zespoły przedwczesnego starzenia mające podłoże genetyczne. Zmniejszona aktywność telomerazy u pacjentów dotkniętych tymi chorobami wywołuje uszkodzenia wielonarządowe, takie jak, marskość wątroby, fibroza płuc, hipogonadyzm, postępująca niewydolność szpiku kostnego, a dodatkowo objawia się nadmiernym rogowaceniem i zanikiem skóry dłoni i stóp, zaburzeniami budowy płytek paznokciowych oraz przebarwieniami błon śluzowych i leukoplakią. Dyskeratoza jest bardzo rzadką chorobą, występującą u jednej osoby na milion, manifestującą się zazwyczaj przed 50-tym rokiem życia. Jak najpełniejsze zrozumienie roli telomerazy w patogenezie molekularnej chorób ma zatem zasadnicze znaczenie dla diagnostyki, poradnictwa genetycznego oraz dla postępowania z osobami chorymi.

Przez wiele lat sądzono, że sekwencje telomerowe u organizmów eukariotycznych nie podlegają procesowi transkrypcji. W ciągu ostatniej dekady badania wykazały jednak, że telomery są transkrybowane, a w tym procesie powstaje cząsteczka RNA bogata w reszty guaniny określana jako TERRA RNA. Transkrypt ten jest następnie wykorzystywany w procesie translacji i umożliwia generowanie dwóch białek zbudowanych z powtarzających się dipeptydów, bogatych w walinę–argininę i glicynę–leucynę. Autorzy publikacji sugerują, że te białka dipeptydowe są wytwarzane w większych ilościach, gdy komórki przechodzą kryzys telomerowy. Ich obfitość mogłaby zmieniać metabolizm kwasów nukleinowych i ogólną syntezę białek oraz wywoływać odpowiedzi zapalne w starzejących się komórkach. Badania nad TERRA RNA i jego funkcjami w ludzkich komórkach są ważne dla zrozumienia mechanizmów starzenia się komórek i chorób związanych z długością telomerów, takich jak niektóre formy raka i choroby genetyczne związane z defektami telomerów.

Na całym świecie prowadzone są obecnie badania kliniczne będące w różnych fazach zaawansowania prac zmierzających do stworzenia nowoczesnych leków działających w mechanizmach molekularnych związanych z funkcjonowaniem ludzkiej telomerazy. Na stronie internetowej clinicaltrials.gov, pod egidą National Institute of Health, można znaleźć informacje na temat ponad 60 badań klinicznych w tym obszarze, a spektrum wskazań i obszarów terapeutycznych jest imponujące. Włóknienie płuc, ostra białaczka mieloblastyczna, choroba Alzhmimera, czerniak, rak płuca, rak pęcherza to tylko wybrane przykłady chorób, które niebawem będą leczone przy użyciu nowych terapii, których mechanizmy działania są oparte na wiedzy dotyczącej funkcjonowania telomerazy. Przykładem jest telomelizyna, adenowirus onkolityczny posiadający zdolność do replikacji jedynie w komórkach nowotworowych i prowadzący do ich lizy. Selektywność działania powoduje, że leczenie wirusami onkolitycznymi jest korzystniejsze niż inne metody stosowane w kuracji onkologicznej, a zwłaszcza mało selektywna konwencjonalna terapia przeciwnowotworowa. Telomelizyna, opracowana przez firmę Oncolys BioPharma, jest onkolitycznym adenowirusem serotypu 5 ze zmodyfikowanym materiałem genetycznym, który selektywnie replikuje się w komórkach nowotworowych poprzez wprowadzenie do wirusa sekwencji promotora genu ludzkiej odwrotnej transkryptazy wchodzącej w skład telomerazy (hTERT). Podczas aktywacji promotora (hTERT) cały aparat komórkowy zmuszony jest do syntezy przede wszystkim białek wirusowych, co prowadzi do onkolitycznej śmierci komórek. Adenowirus onkolityczny ma duży potencjał w immunoterapii raka, ponieważ jego replikacja jest wysoce immunogenna, a onkoliza indukowana przez taki wirus uwalnia antygen nowotworowy i dostarcza układowi odpornościowemu stymulujących sygnałów o niebezpieczeństwie.

Literatura:

B. McClintock, The stability of broken ends of chromosomes in Zea mays. Genetics 26, 234–282 (1941).
J. Meyne, R. L. Ratliff, R. K. Moyzis, Conservation of the human telomere sequence (TTAGGG)(n) among vertebrates. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86, 7049–7053 (1989).
T. de Lange, Shelterin-mediated telomere protection. Annu. Rev. Genet 52, 223–247 (2018).
J. D. Griffith et al., Mammalian telomeres end in a large duplex loop. Cell 97, 503–514 (1999).
Mammalian telomeric RNA (TERRA) can be translated to produce valine–arginine and glycine–leucine dipeptide repeat proteins. PNAS. https://doi.org/10.1073/pnas.2221529120 (2023)
C. M. Azzalin, J. Lingner, Telomere functions grounding on TERRA firma. Trends Cell Biol. 25, 29–36 (2015).
Z. Wang et al., Telomeric repeat-containing RNA (TERRA) constitutes a nucleoprotein component of extracellular inflammatory exosomes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 112, E6293–E6300 (2015).
C. A. Perez-Romero, M. Lalonde, P. Chartrand, E. Cusanelli, Induction and relocalization of telomeric repeat-containing RNAs during diauxic shift in budding yeast. Curr. Genet. 64, 1117–1127 (2018).
A. Porro, S. Feuerhahn, P. Reichenbach, J. Lingner, Molecular dissection of telomeric repeatcontaining RNA biogenesis unveils the presence of distinct and multiple regulatory pathways. Mol. Cell Biol. 30, 4808–4817 (2010).
Z. Deng, J. Norseen, A. Wiedmer, H. Riethman, P. M. Lieberman, TERRA RNA binding to TRF2 facilitates heterochromatin formation and ORC recruitment at telomeres. Mol. Cell 35, 403–413 (2009).
P. N. Le, D. G. Maranon, N. H. Altina, C. L. R. Battaglia, S. M. Bailey, TERRA, hnRNP A1, and DNA-PKcs interactions at human telomeres. Front Oncol. 3, 91 (2013).
R. Arora, C. M. Azzalin, Telomere elongation chooses TERRA ALTernatives. RNA Biol. 12, 938–941 (2015)

RFT w starzeniu organizmu

Blog naukowy -portal wiedzy / By Łukasz Sobkowiak / 26 lutego, 2024

W ludzkim organizmie przebiega szereg reakcji, które odbywają się przy udziale enzymów utleniających. Często w procesach utleniania powstają silnie reaktywne półprodukty, które nazywane są reaktywnymi formami tlenu – RFT. Do takich cząsteczek możemy zaliczyć nadtlenek wodoru, anionorodnik ponadtlenkowy oraz rodnik tlenku azotu. Reaktywne formy tlenu stanowią poważne zagrożenie z tego powodu, że wchodzą one w reakcje z białkami, lipidami oraz kwasami nukleinowymi. Przykładowo reakcja peroksydacji lipidów prowadzi do wytworzenia tzw. adduktów, które powstają przez połączenie dwóch cząsteczek o charakterze lipidowym (czasem jest to połączenie białka z lipidem). Wytworzenie adduktów lipidowych albo lipidowo-białkowych wpływa bezpośrednio na błony komórkowe – ograniczając ich płynność. Jeśli ograniczenie płynności błony dotyczy błon mitochondrialnych, to może doprowadzić do zaburzeń w funkcjonowaniu łańcucha oddechowego, który jest z kolei zaangażowany w syntezę cząsteczek ATP – głównego nośnika energii w komórce. Tworzenie adduktów może również uszkadzać integralność błon mitochondrialnych, co dla komórki jest z kolei sygnałem do rozpoczęcia procesu programowanej śmierci komórki czyli apoptozy.

Wolnorodnikowe uszkodzenia mitochondriów oraz spadek wydajności syntezy cząsteczek ATP są częstymi zjawiskami biochemicznymi, obserwowanymi w starzejących się komórkach człowieka. Starzejące się komórki, skierowywane są na szlak apoptozy – dzięki temu są one niszczone i zastępowane nowymi komórkami. Dziś już doskonale wiemy o tym, że mitochondria ogrywają bardzo istotną rolę w procesie indukowania szlaków apoptotycznych. Proces apoptozy może zostać wywołany różnymi stresorami, które gromadzą się w starzejących się komórkach – czynniki te prowadzą do powstania kanałów w zewnętrznej błonie mitochondrialnej, przez które do cytoplazmy uwalniany jest cytochrom c. Komórki w fazie starzenia się napędzają dysfunkcję tkankową związaną z wiekiem częściowo poprzez indukcję przewlekłego fenotypu sekrecji związanego ze starzeniem (SASP). Istotą SASP jest wydzielanie cytokin prozapalnych, chemokin, czynników wzrostu, proteaz oraz bioaktywnych lipidów. Mitochondria są głównymi regulatorami SASP; jednak mechanizmy tego procesu nie zostały jeszcze wyjaśnione. Podczas programowanej śmierci komórki, nieodwracalna i rozległa permabilizacja zewnętrznej błony mitochondrialnej (MOMP) skazuje komórkę na śmierć i jest to moment krytyczny procesu apoptozy. MOMP jest kontrolowana przez białka apoptotyczne BID i BAX, które wbudowują się w wewnętrzną błonę mitochondrialną i tworzą w niej pory, przez które następnie następuje przeciek protonów do wnętrza mitochondriów. Za powiększanie porów odpowiedzialne jest białko BAK. Ostatecznie procesy te doprowadzają do obniżenia potencjału błony mitochondrialnej, i uszkodzenia łańcucha oddechowego, co prowadzi do uwolnienia białek mitochondrialnych, z których najistotniejszy jest cytochrom c. Ponadto cytochrom c wspólnie z czynnikiem Apaf1 i kaspazą 9 wchodzą w skład kompleksu apoptosomu, który aktywuje kaspazy wykonawcze CASP3/6/7. Odkryto, że MOMP występujący w podzbiorze mitochondriów jest cechą komórkowego procesu starzenia się – jest to tzw. MOMP mniejszościowy (miMOMP) prowadzący do uwolnienia mitochondrialnego DNA (mtDNA) do cytozolu.

Cytozolowy mtDNA z kolei aktywuje ścieżkę cGAS–STING, głównego regulatora SASP. Odkryto, że inhibicja miMOMP in vivo obniża poziom markerów zapalnych i poprawia stan zdrowia u starych myszy. Wyniki sugerują, że apoptoza i starzenie się są regulowane przez podobne mechanizmy zależne od mitochondriów i że podletalny stres apoptotyczny mitochondrialny jest głównym napędzającym SASP. Wykazano, że inhibicja sterylnego stanu zapalnego związanego ze starzeniem wywołanego przez miMOMP może być terapeutyczną drogą do poprawy zdrowia poprzez łagodzenie stanów zapalnych. Białka kaspazowe (proteazy cysteinowe) obecne w apoptosomie inicjują procesy proteolitycznej degradacji białek w komórce, co ostatecznie prowadzi do jej śmierci i usunięcia poprzez komórki fagocytujące. Zgodnie z mitochondrialną teorią starzenia się organizmu ciągłe, akumulujące się i niemożliwe do powstrzymania reakcje wolnych rodników tlenowych prowadzą do postępujących procesów starzenia się człowieka.

Tlen jest niezbędny do życia organizmu i z tego powodu w trakcie ewolucji powstały białka zaangażowane w mechanizmy pozbywania się RFT z komórki, co prowadzi do niwelowania szkodliwego wpływu związków o charakterze rodnikowym. W organizmie człowieka występują enzymy, które stanowią naturalne zabezpieczenie przed szkodliwymi rodnikami tlenowymi. Dysmutaza ponadtlenkowa to enzym z grupy oksydoreduktaz katalizujący dysmutację anionorodnika ponadtlenkowego. Dysmutaza ponadtlenkowa przekształca anionorodnik ponadtlenkowy w tlen i nadtlenek wodoru (H₂O₂), zmniejszając tym samym szkodliwość reaktywnych form tlenu. Katalaza natomiast rozkłada nadtlenek wodoru na wodę i tlen, zapobiegając gromadzeniu się H₂O₂, który może być szkodliwy dla komórki.

Przed RFT i uszkodzeniami w mitochondriach organizm może się wydajnie bronić jeśli wesprzemy jego działanie dietą i dostarczając odpowiednich suplementów diety. Przykładowo urolityna A (UA) indukuje w komórkach mitofagię – dzięki temu uszkodzone mitochondria są usuwane. Urolityna A łagodzi stany zapalne poprzez atenuację szlaku cGAS/STING. Urolityna poprawia też funkcje neurologiczne. Urolityna A jest związkiem, który powstaje w wyniku metabolizmu elagotanin przez bakterie jelitowe. Źródłami elagotanin są: orzechy oraz niektóre owoce jagodowe: maliny, truskawki, jeżyny, granat. Doustne suplementowanie urolityną A, prowadzi do aktywacji mitofagii.

Coraz większym zainteresowaniem w kontekście długowieczności cieszy się w ostatnim czasie cząsteczka ergotioneiny. Ergotioneina ma działanie antyoksydacyjne i przeciwzapalne. Dodatkowo udowodniono, że jest ona modulatorem kilku ważnych szlaków biochemicznych w komórce: wpływa na szlak sirtuinowy, szlak mTOR, szlak insulinopodobnego czynnika wzrostu (IGF1) oraz reguluje działanie czynnika transkrypcyjnego FOXO. Ergotioneina coraz częściej nazywana jest „cząsteczką długowieczności”. Całkiem spore ilości tego związku są zawarte w grzybach, a szczególnie bogate w ergotioneinę są pieczarki oraz boczniak szary.

Bardzo bogatym źródłem polifenolowych związków o charakterze antyoksydacyjnym i przeciwzapalnym jest olej z nasion dzikiej róży. Zawiera on bowiem cenne przeciwutleniacze lipofilowe zaliczane do tokoferoli, a ponadto likopen i β-karoten. Olej z nasion dzikiej róży zawiera też niezbędne nienasycone kwasy tłuszczowe – w tym kwasy omega-3. Warto w kontekście przeciwutleniaczy korzystać też z oleju z pestek czarnej porzeczki – olej ten zawiera bogactwo fitosteroli, flawonoidów, kwasów fenolowych oraz karotenoidów. Oprócz wymienionych związków w oleju z pestek czarnej porzeczki znajdują się również: kwas gamma-linolenowy (GLA), kwas alfa-linolenowy (ALA) oraz kwas stearydynowy, który rzadko jest spotykany w źródłach roślinnych. Dodatkową zaletą oleju z pestek czarnej porzeczki jest wysoka zawartość witaminy E – która ma istotne znaczenie w antyoksydacyjnej ochronie organizmu i dodatkowo wspiera prawidłowe funkcjonowanie wątroby. Urozmaicona dieta, bogata w fitozwiązki oraz w substancje zawarte w grzybach przyczyni się do poprawy zdrowia i samopoczucia.

Literatura:

1. Gorgoulis, V. et al. Cellular senescence: defining a path forward. Cell 179, 813–827 (2019).
2. Correia-Melo, C. et al. Mitochondria are required for pro-ageing features of the senescent phenotype. EMBO J. 35, 724–742 (2016).
3. Bock, F. J. & Tait, S. W. G. Mitochondria as multifaceted regulators of cell death. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 21, 85–100 (2020).
4. Pignolo, R. J., Passos, J. F., Khosla, S., Tchkonia, T. & Kirkland, J. L. Reducing senescent cell burden in aging and disease. Trends Mol. Med. 26, 630–638 (2020).
5. Apoptotic stress causes mtDNA release during senescence and drives the SASP. Nature. https://doi.org/10.1038/s41586-023-06621-4 (2023)
6. Mitophagy curtails cytosolic mtDNA dependent activation of cGAS/STING inflammation during aging. Nature Communications. https://doi.org/10.1038/s41467-024-45044-1 (2024)