Historia badań nad DNA i RNA

W 2002 roku badacze złożyli od podstaw wirusa polio, a w 8 lat od tego wydarzenia Craig Venter ogłosił światu, że jego prace badawcze doprowadziły do konstrukcji syntetycznego genomu bakterii Mycoplasma genitalium, który następnie ożywiono poprzez transplantację materiału genetycznego do innego, blisko spokrewnionego organizmu – tym sposobem na świat przyszła Synthia, syntetyczny mikroorganizm. Na ten przełomowy moment, rodem z filmów science fiction składają się tysiące  lat mniej, bądź bardziej świadomych, działań człowieka, który 7 milionów lat temu, czyli stosunkowo niedawno, oddzielił się ewolucyjnie od linii szympansiej i zaledwie 75 milionów lat od punktu czasowego, w którym nasza ewolucja rozdzieliła się od linii mysiej. Czy przyszedł niebezpieczny czas na patentowanie życia? Znaczna część systemów prawnych na świecie pozwala na patentowanie genetycznie modyfikowanych roślin i produktów wytwarzanych przez genetycznie modyfikowane bakterie (np. insulina) oraz zwierzęta (np. włókna fibroinowe nici pajęczej wydzielane w mleku kóz zmodyfikowanych przez kanadyjską firmę biotechnologiczną Nexia). W Europie oraz w Kanadzie,
w sposób bardzo kontrowersyjny i budzący ogromny sprzeciw, posunięto się znacznie dalej i za własność intelektualną, chronioną patentem, uznano ssaczy (dokładniej mysi) organizm genetycznie modyfikowany – OncoMouse, mysz laboratoryjną, która jest szeroko wykorzystywana przez biologów molekularnych w pracach eksperymentalnych dotyczących nowotworów.

Ludzkość modyfikowała genetycznie żywe organizmy przez tysiące lat. Proces ten zapoczątkowały rzecz jasna selektywnie hodowane rośliny. Człowiek wiedziony intuicją oraz poprzez ocenę organoleptyczną potrafił dostrzegać w niektórych roślinach oraz w ich właściwościach pewne zasadnicze cechy, takie jak smak, wielkość i soczystość owoców, rozmiar nasion, wytrzymałość na zmienne warunki środowiska, które sprawiały że uznawał je za lepsze w stosunku do pozostałych odmian. Tym oto sposobem, poprzez oczywistą ingerencję człowieka, selekcjonowano i udomawiano wybrane organizmy, które następnie były wybierane do dalszej hodowli, która utrwalała pożądane cechy i prowadziła ostatecznie do widocznych różnic w stosunku do odmian rosnących dziko. Następstwo takiej przemyślanej, selektywnej hodowli, obserwujemy nawet dziś, tysiące lat później – genomy roślin uprawianych obecnie, takich jak maniok, jabłka, kukurydza czy groch, różnią się bowiem znacznie od materiału genetycznego gatunków wyjściowych. Rolnictwo było zatem praktycznie od początku obszarem rozwijającym genetykę, choć człowiek nie był jeszcze tego w pełni świadomy. Wiele lat później, w latach 20-tych ubiegłego wieku, za sprawą prac Hermanna Mullera, otrzymaliśmy narzędzia służące do bardziej ukierunkowanych metod mutagenezy roślin – zdano sobie sprawę z tego, że tworzenie odmian roślin można akcelerować poprzez stosowanie podejścia fizycznego i chemicznego. W mutagenezie roślin  zaczęto wykorzystywać  promieniowanie jonizujące (promienie X, promienie gamma, alfa, beta, protony oraz neutrony), elektromagnetyczne i ultrafioletowe, chemiczne czynniki alkilujące (EMS – metylosulfonian etylu, DEB – diepoksybutan) oraz radiomimetyczne związki chemiczne, takie jak etyloimina (EI) oraz N-nitrozo-N-etylomocznik (NEU), powodujące w DNA uszkodzenia podobne do efektów działania promieniowania jonizującego. Wymienione metody były używane głównie jako narzędzia tzw. wstecznej genomiki funkcjonalnej, która za cel stawiała wyjaśnienie funkcji poszczególnych genów roślinnych, jednak przy okazji doprowadziła do powstania wielu nowych odmian – za przykład niech tutaj posłuży uwielbiany przez nas czerwony grejpfrut, który powstał na drodze mutagenezy z użyciem napromieniowania radioaktywnego.

Podczas studiów biologicznych temat mutagenezy zainteresował mnie do tego stopnia, że postanowiłem zająć się nim przy pisaniu pracy licencjackiej. Wówczas, 15 lat temu, przeprowadziłem swój pierwszy eksperyment naukowy, którego celem było wyselekcjonowanie mutantów supresorowych roślinnego organizmu modelowego Arabidopsis thaliana, w których zmiany genetyczne pod wpływem metylosulfonianu etylu, miały doprowadzić do uzyskania roślin abh1 o złagodzonym fenotypie związanym wrażliwością na obecność kwasu abscysynowego (ABA) – tak uzyskane rośliny miały być w kolejnym etapie użyte w pracach badawczych pozwalających na zidentyfikowanie białek i cząsteczek RNA zaangażowanych w przekazywanie sygnału kwasu abscysynowego, fitohormonu z rodziny sekswiterpenów, który w odpowiedzi na stres wywołany brakiem dostępności do wody w glebie powoduje zamykanie aparatów szparkowych liścia, chroniąc tym samym roślinę przed utratą życiodajnego płynu. Prace nad rozwikłaniem szlaku sygnałowego kwasu abscysynowego prowadziłem po to, aby rozwinąć w naszej pracowni projekt zmierzający do uzyskania nowych odmian roślin odpornych na warunki suszy. Wyniki były niejednoznaczne, zająłem się inną tematyką, związaną z interferencją cząsteczek RNA i regulacją ekspresji genów
w komórkach, projekt uzyskania roślin odporniejszych na brak wody poprowadziła dalej jedna z doktorantek, a finalnie kilka lat później przy użyciu techniki wyciszania genów przez udział sztucznych mikro RNA (a-miRNA, artificial-micro RNA) w laboratorium koledzy uzyskali zmodyfikowaną roślinę ziemniaka odporną na suszę. Na chwilę stało się o tym bardzo głośno, laboratorium odwiedzały kolejno stacje telewizyjne, dziennikarze piszący dla gazet i przeprowadzający wywiady dla radia. Do dziś z uśmiechem wspominam historię pewnego telefonu wykonanego przez żartownisia ze stacji radiowej, który chcąc wkręcić szefową laboratorium w dowcip, zapytał czy wódka produkowana ze zmienionych genetycznie ziemniaków będzie bardziej znośna dla konsumentów i będzie po jej spożyciu mniej „suszyć” w gardle o poranku po zakrapianym wieczorze. Bulwy ziemniaków, z tego co wiem, nigdy nie zostały użyte do pędzenia samogonu, a oprócz oczywistego pożytku intelektualnego płynącego z opracowania genetycznie zmodyfikowanego ziemniaka, bulwy zostały przez nasz zespół badawczy bezceremonialnie pożarte w sałatce, podczas jednego z cotygodniowych seminariów poświęconych postępowi prac eksperymentalnych w realizowanych projektach grantowych, ostatecznie przetrawione i  weszły w dalszy obieg materii wydalone z organizmów studentów, doktorantów i profesorów w procesie defekacji – albowiem do komercyjnej uprawy GMO na terenie Unii Europejskiej dopuszczono jedynie modyfikowaną kukurydzę, której hodowlę w Polsce i tak zakazano mocą ustawy w 2013 roku.

Obecnie biologia i medycyna dysponują potężnymi narzędziami, które doprowadziły do rewolucji biomedycznej. Nie byłoby to jednak możliwe bez postępu w tzw. naukach podstawowych, których udział był niezbędny do tego, aby ludzkość poczyniła gigantyczny krok zmierzający do poskromienia natury i umożliwiający stworzenie narzędzi stosowanych w inżynierii genetycznej, która z kolei w sposób oczywisty dała początek rozwojowi nowoczesnych terapii na choroby, które wcześniej były nieuleczalne. Prześledźmy historię najważniejszych odkryć naukowych, które doprowadziły nas do obecnego stanu rzeczy.

Na początku lat 30-tych XIX wieku Karol Darwin wybrał się w podróż morską na statku badawczym HMS Beagle, wyprawa ta umożliwiła mu zapoznanie się z florą i fauną Ameryki Południowej – w sposób wyjątkowy zainspirowały go obserwacje kilku gatunków zięb, z którymi zetknął się na Wyspach Galapagos, położonych nieco na zachód od Ekwadoru. Wyprawa Darwina i obserwacje naukowe poczynione w jej trakcie umożliwiły stworzenie teorii ewolucji, w której nowe gatunki powstają poprzez dobór naturalny, utrwalający w populacji pożądane cechy i zapewniający przetrwanie najlepiej przystosowanym osobnikom. Teoria ewolucji Darwina została zaprezentowana w 1958 roku, a już w kolejnym roku naukowiec opublikował pracę pt. „ O powstawaniu gatunków drogą doboru naturalnego, czyli o utrzymywaniu się doskonalszych ras organicznych w walce o byt”. Przed Darwinem (a nawet współcześnie) zakładano istnienie inteligentnego, kreacjonistycznego projektu opisującego powstanie i rozwój życia na Ziemi, posługując się nawet w tym celu bardzo obrazową analogią, porównującą wielopoziomową złożoność życia do skomplikowanego mechanizmu zegarka znalezionego gdzieś na wrzosowisku, którego zaistnienie w naturze zakłada a priori istnienie inteligentnego i wyspecjalizowanego zegarmistrza działającego z niebywałą precyzją.  Zegarmistrz faktycznie istniał, jednak był ślepy i działał metodą prób i błędów. W czasie, gdy Karol Darwin pracował nad teorią ewolucji, na scenę teatru nauki wkroczył Grzegorz Mendel – mnich i zapalony ogrodnik przebywający wówczas w klasztorze św. Tomasza w Brunn. Choć prace Mendla doprowadziły do przełomowego ustalenia podstawowych praw dziedziczenia genetycznego, sam Mendel i jego odkrycia pozostały niezauważone przez współczesnych, a odkryto je ponownie dopiero 16 lat po śmierci badacza. Publikacja Karola Darwina była sensacją, waga odkryć Grzegorza Mendla pozostała niedoceniona – sam Darwin przeoczył publikację Mendla, która stanowiła przecież oczywiste dopełnienie jego własnych obserwacji naukowych. Na ironię artykuł Mendla na temat praw dziedziczenia, który obalał teorię pangenezy, został opublikowany w tym samym tomie, w którym Darwin komentował prace innych badaczy – było naprawdę blisko. Dziś dysponujemy znacznie szerszą wiedzą i zdajemy sobie sprawę z niedoskonałości praw dziedziczenia opisanych przez morawskiego mnicha, jednak zawdzięczamy jego pracom:

  1. Prawo segregacji, które mówi o tym, że cechy dziedziczone są zapisane w formie kilku różnych wariantów (dziś nazywamy je allelami), które warunkują ostatecznie cechy fenotypowe organizmu. Allele dziedziczone są po jednym od każdego z rodziców i mogą mieć charakter dominujący (wyrażany fenotypowo) bądź recesywny (ustępujący allelowi dominującemu).
  2. Prawo niezależnego przekazywania cech, zakładające, że sposób przekazywania jednej z cech nie wpływa na dziedziczenie innej cechy – dziś wiemy, że niektóre allele warunkujące różne cechy fenotypowe są ze sobą sprzężone genetycznie i wymykają się prostemu, mendlowskiemu, mechanizmowi dominacji cech zaobserwowanemu u grochu.

W 1900 roku Hugo de Vries, Carl Correns i Erich von Tschemak wskrzesili do życia zapomniane wyniki prac eksperymentalnych Mendla wykonanych na nasionach grochu. W latach 40-tych XIX wieku odkryto w komórkach istnienie chromosomów, jednak dopiero w roku 1902, za sprawą niezależnych prac biologa Theodora Boveri i genetyka Waltera Suttona, pojawiła się sugestia, że te tajemnicze, pałeczkowate struktury, obecne w jądrze komórkowym, mogą w istocie zawierać materiał dziedziczny. W tym czasie nie znano jeszcze pojęcia genu, które pierwszy raz pojawiło się dopiero w pracach Wilhelma Johannsena w roku 1909 i ostatecznie wyparło zaproponowany przez Hugo de Vriesa termin pangenu, definiowany jako najmniejsza cząstka pojedynczej cechy dziedzicznej. Chromosomowe podstawy dziedziczenia cech zostały dowiedzione już 1910 roku dzięki badaniom przeprowadzonym przez T. H. Morgana na modelu badawczym, jakim była wywilżna karłowata (Drosophila melanogaster) potocznie nazywana muszką owocową. Thomas Hunt Morgan poprzez określenie genu, jako fizycznej jednostki zlokalizowanej w chromosomie oraz poprzez użycie metod statystycznych w swoich badaniach przekształcił biologię z nauki opisowej w dziedzinę eksperymentalną, opisywaną liczbowo – od tego mementu biologia stanęła na równi z chemią i fizyką. Morgan za swój wkład do rozwoju nauki otrzymał w 1933 roku Nagrodę Nobla w dziedzinie fizjologii i medycyny.  Obecnie każdy w miarę sumienny licealista potrafi odpowiedzieć na pytanie o liczbę ludzkich chromosomów. Historia pokazuje jednak, że nie było to wcale oczywiste do roku 1955, w którym dwójka badaczy Albert Levan i Joe-Hin Tjio udowodniła, że ludzkie gamety zawierają 23 chromosomy, a na prawidłowy kariotyp komórek somatycznych składa się 46 chromosomów – 44 chromosomy autosomalne i dwa chromosomy warunkujące płeć. Do czasu tego przełomowego odkrycia powszechne było przekonanie, że człowiek podobnie jak szympans posiada 24 chromosomy w komórkach rozrodczych, a pełen kariotyp zawiera 48 chromosomów. Faktycznie w niezbyt odległej przeszłości posiadaliśmy 48 chromosomów, ich liczba w toku ewolucji została jednak zredukowana poprzez fuzję dwóch chromosomów, które dziś wspólnie tworzą ludzki chromosom 2 – niewątpliwie było bardzo ważne wydarzenie ewolucyjne, stanowiące jeden z przełomów, który poprowadził nas ścieżką od wielkich małp do Homo sapiens. Skoro organizmy z taką fuzją materiału genetycznego przetrwały po dziś i rozprzestrzeniły się po świecie, oznacza to jednoznacznie, że było to korzystne z jakiegoś powodu i dobór naturalny promował osobniki o zredukowanej liczbie chromosomów. Z medycznego punktu widzenia ilość chromosomów jest niebywale istotna i warunkuje prawidłowy rozwój oraz wpływa na stan zdrowia człowieka. Współczesna medycyna doskonale zna pojęcie aneuploidii – zjawisko to polega na wzbogaceniu bądź zubożeniu komórek o jeden bądź więcej chromosomów, co prowadzi do patologicznej sytuacji, w której prawidłowy zestaw chromosomów (tzw. euploidia) zostaje przekształcony w formę pośrednią, niewłaściwą dla prawidłowo utworzonych komórek gamet i komórek budujących organizm. Aneuploidia jest następstwem aberracji chromosomowych (zmiana struktury, bądź liczby chromosomów), czyli pewnego rodzaju mutacji, do której dochodzi na drodze nondysjunkcji, polegającej z kolei na nieprawidłowym rozdzieleniu materiału genetycznego podczas podziału komórki – odpowiedzialne za taką sytuację jest nieprawidłowo wykształcone wrzeciono kariokinetyczne, będące czymś w rodzaju sznurków zbudowanych z białek, które przy rozdziale materiału genetycznego są z nim połączone, a przez skracanie swojej długości pociągają za sobą chromosomy do biegunów nowych komórek zanim dojdzie do ostatecznego podziału.  Nieprawidłowy podział materiału genetycznego może przykładowo doprowadzić do stanu, gdy w komórce oprócz dwóch prawidłowych kopii pojawia się dodatkowy trzeci chromosom – jest to tzw. trisomia. Najlepiej poznanym przykładem choroby powodowanej przez trisomię jest zespół Downa, a osoby cierpiące z tego powodu posiadają w komórkach po 3 kopie chromosomu 21. Trisomia chromosomu 18 prowadzi z kolei do fenotypu zespołu Edwardsa manifestującego się wadami rozwojowymi i głębokim upośledzeniem umysłowym. Wystąpienie u płodu trisomii chromosomu 13, wywołującej zespół Patau, znacznie zwiększa ryzyko poronienia bądź śmierci dziecka tuż po urodzeniu. Dzieci, które urodziły się z tą chorobą w 70% umierają przed osiągnięciem pierwszego roku życia i cierpią z powodu poważnych deformacji rozwojowych objawiających się w postaci aplazji (niewykształcenia) skóry skalpu, niedokonanego podziału przodomózgowia czyli holoprozencefalii oraz  wad wielonarządowych. Znane są również aneuploidie dotyczące chromosmów płci X i Y, które w toku ewolucji człowieka zostały oddzielone około 300 milionów lat temu. Zespół Turnera, który występuje jedynie u kobiet, pojawia się w następstwie monosomii chromosomu X i powoduje poważne następstwo w postaci bezpłodności wynikającej z niedorozwoju jajników, dodatkowo osoby dotknięte chorobą są zazwyczaj niskie i charakteryzują się krępą budową ciała. U niektórych mężczyzn obserwowany jest zespół Klinefeltera, który pojawia się gdy w kariotypie występują dwa chromosomy X i jeden chromosom Y – wynikiem takiej trisomii jest bezpłodność spowodowana niedorozwojem jąder oraz obecność cech żeńskich w fenotypie. Znane są również przypadki tzw. „supersamców”, którzy posiadają dwa chromosomy Y oraz jeden chromosom X w swoich jądrach komórkowych, co powoduje bardzo wysoki wzrost i pewną nadpobudliwość emocjonalną, nie wywołuje jednak bezpłodności.

Jako ciekawostkę ze świata zwierząt warto w tym miejscu wspomnieć o ślepcu stepowym (Spalax microphthalmus), niewielkim gryzoniu zamieszkującym w górach Kaukazu, który w toku ewolucji całkowicie stracił chromosom Y, a mimo to pozostaje samcem. Wspominam o tym nie bez powodu, gdyż przerażająca wizja totalitarnego świata bez mężczyzn, humorystycznie pokazana w „Seksmisji” wyreżyserowanej przez Janusza Machulskiego w 1983 roku, wcale nie jest niemożliwa. Więcej, jest możliwa. Być może, w tym momencie panowie czytający tą książkę przestają się uśmiechać na wspomnienie perypetii Maksa i Alberta, którzy po poddaniu się dobrowolnej hibernacji, w 1991 roku, zostają nagle wybudzeni w nowej rzeczywistości, w nowym porządku świata, będącym następstwem użycia bomby M, której niszczycielska moc doprowadziła do zniszczenia męskiej populacji przez anihilację męskich genów w populacji Homo sapiens zamieszkujących Ziemię. Jest rok 2044, a doktor Lumia informuje samców o tym, że są reliktem dawnego systemu, kobiety „produkują” drogą inżynierii genetycznej i metodami in vitro jedynie dzieci płci żeńskiej i generalnie świat bez chromosomu Y jest prawie doskonały, a w każdym razie lepszy niż był. Niestety „Seksmisja” nie powstała całkowicie w oparciu o fantazję i do pewnego stopnia ma całkiem solidne podstawy naukowe. Chromosomy płci zostały zidentyfikowane w 1905 roku przez Nattie Stevens i Edmunda Beecher Wilsona. Chromosom X, warunkujący płeć żeńską, ma olbrzymią przewagę nad  chromosomem Y, który podlega stopniowej, i co gorsza, systematycznej degradacji. Podczas gdy chromosom X może ulegać mechanizmowi rekombinacji homologicznej z siostrzanym chromosomem X, który tworzy parę u kobiet, w trakcie crossing-over podczas podziału mejotycznego, Y ma ograniczone możliwości zmienności rekombinacyjnej. Przy braku obecności homologicznego chromosomu Y degeneruje sukcesywnie w sposób zgodny z mechanizmem tzw. zapadki Mullera i z tego powodu obserwowany dziś męski chromosom zawiera znacznie mniej informacji genetycznej w stosunku do tej, która była w nim zapisana u naszych nieodległych samczych przodków. Zanikanie chromosomu Y na skutek stopniowych delecji pewnych jego fragmentów określane jest często mianem „przekleństwa Adama”. Część pesymistycznych naukowców zakłada, że przy obecnie obserwowanym tempie degeneracji chromosom Y zaniknie w populacji za około 125 000 lat i doprowadzi do wymarcia naszego gatunku. Niektórzy genetycy postrzegają przyszłość w bardziej optymistycznych barwach
i przewidują, że przed ostateczną klęską mężczyzn uchroni nas istnienie doboru naturalnego, który będzie eliminował z puli genowej mutacje wieszczące katastrofę ludzkości – szkodliwe warianty genetyczne, o ile powstaną, będą najprawdopodobniej prowadzić do bezpłodności i zostaną tym samym wyeliminowane brakiem możliwości ich przekazania do kolejnego pokolenia. Jednym z najistotniejszych spośród około 80 genów zlokalizowanych w chromosomie Y jest gen SRY (ang. sex-determining region Y), który jest niezbędny do powstania płci męskiej u człowieka poprzez uruchomienie programu rozwojowego prowadzącego do wykształcenia jąder – brak ekspresji genu SRY w komórkach rozwijającego się płodu skutkuje rozwojem gonad żeńskich. Kluczowa rola genu SRY w maskulinizacji może nas uratować przed wyginięciem albowiem szkodliwe mutacje tego fragmentu chromosomu będą eliminować ich nosicieli.

Na początku XX wieku biolodzy wiedzieli już, że za dziedziczenie cech odpowiadają chromosomy, nadal brakowało jednak istotnych części układanki, które były niezbędne na drodze zmierzającej do wyjaśnienia molekularnych podstaw ich działania. Kwas dezoksyrybonukleinowy (DNA) został odkryty przez Johanna Friedricha Mieschera w 1869 roku. Szwajcarski badacz metabolizmu, podczas prac na uniwersytecie w Tybindze, wyizolował wówczas z bandaży nasiąkniętych ropą pacjentów substancję, którą nazwał nukleiną, jednak potrzeba było jeszcze wielu lat aby wykazać eksperymentalnie rolę kwasów nukleinowych w mechanizmie dziedziczenia. Istotny krok w tym kierunku poczynił brytyjski lekarz Frederic Griffith, który w 1928 roku pracował nad szczepionką dającą odporność na zapalenie płuc i wykorzystując jako model badawczy szczepy bakterii Pneumococcus,  jako pierwszy opisał fenomen transformacji DNA – proces pobierania molekuł kwasu nukleinowego z otoczenia przez organizmy jednokomórkowe. Badacz miał do dyspozycji dwa szczepy bakterii: formę zdolną do wytwarzania otoczki polisacharydowej i prowadzącą do śmierci (forma S) i zupełnie bezbronny szczep R, który nie syntetyzował otoczki, co czyniło go łatwym celem dla układu immunologicznego. Griffith zaobserwował, że podanie myszom laboratoryjnym zjadliwego szczepu S, po jego uprzednim uśmierceniu pod działaniem wysokiej temperatury, nie doprowadzało do uśmiercenia gryzoni, jeśli jednak martwe pneumokoki szczepu S wstrzykiwano z żywymi bakteriami niezjadliwymi typu R myszy za każdym razem zdychały. Naukowiec poszedł krok dalej i po wyizolowaniu bakterii z martwych myszy zauważył, że niezjadliwe bakterie pod wpływem „czynnika transformującego” nabierały zdolności do wytwarzania otoczki polisacharydowej charakterystycznej dla śmiertelnego szczepu S i tym samym potrafiły wymknąć się mechanizmom obronnym układu odpornościowego w rezultacie doprowadzając myszy do śmierci. Choć Griffith miał świadomość istnienia „czynnika transformującego” bakterie, to jednak nie potrafił udowodnić w sposób eksperymentalny roli DNA w tym mechanizmie. Dopiero szesnaście lat później, bo w 1944 roku, Oswald Avery, Maclyn McCarty i Colyn MacLeod  dokonali przełomu wykazując z dużym prawdopodobieństwem rolę DNA w procesie transformacji bakterii. Badacze w serii starannie zaplanowanych eksperymentów krok po kroku oczyszczali tajemniczy czynnik transformujący bakterie wykorzystując metody fizykochemiczne i enzymatyczne inaktywatory organicznych składników komórki bakteryjnej. Dokonali rozdziału komórek bakteryjnych na poszczególne frakcje: białka, tłuszcze, polisacharydy i kwasy nukleinowe (DNA i RNA). Choć oczyszczona substancja zdolna do transformacji wykazywała charakterystyczny dla DNA stosunek ilościowy atomów fosforu i azotu oraz podlegała degradacji przez enzymy wykazujące aktywność niszczącą kwasy nukleinowe, badacze pozostawali ostrożni w ostatecznej interpretacji swojego eksperymentu, mając w świadomości możliwość zanieczyszczenia „czynnika transformującego” nieznaczną ilością DNA, wystarczającą do tego, aby wprowadzić ich w błąd. Dziś naukowcy są zgodni co do faktu, że eksperyment był pierwszym dowodem wskazującym, że kwasy nukleinowe są materiałem genetycznym, jednak w tamtym czasie nie wszyscy byli o tym w pełni przekonani, a wielu uważało, że zaobserwowany fenomen biologiczny dotyczy jedynie bakterii i ma za pewne niewiele wspólnego z genetyką organizmów eukariotycznych, a w szczególności z genetyką człowieka. Przełomowe znaczenie odkrycia procesu transformacji komórek bakteryjnych dodatkowo podkreśla fakt, że zjawisko to jest po dziś wykorzystywane jako standardowe narzędzie w biologii molekularnej, inżynierii genetycznej oraz w biotechnologii do dostarczania materiału genetycznego do wnętrza komórek poddawanych eksperymentom.

Ostatecznego dowodu dostarczyli w 1952 roku genetycy Alfred Hershey i Martha Chase w bardzo pomysłowych jak na tamte czasy eksperymentach przeprowadzonych podczas prac badawczych prowadzonych nad cyklem replikacyjnym bakteriofagów czyli wirusów infekujących komórki bakteryjne. Naukowcy wiedzieli o tym, że bakteriofagi namnażają się wewnątrz bakterii prowadząc ostatecznie do ich rozpadu i uwolnienia ogromnej ilości nowych bakteriofagów zdolnych do infekowania kolejnych komórek. Hershey i Chase w jednej z probówek wyznakowali białka wirusowe radioaktywnym izotopem siarki 35S (aminokwasy białkowe metionina i cysteina zawierają siarkę) natomiast DNA bakteriofagów w drugiej probówce zawierał radioaktywny izotop fosforu 32P (wiązania 3’5’-fosfodiestrowe w DNA zawierają atomy fosforu). W kolejnym etapie eksperymentu infekowano bakterie przy wykorzystaniu bakteriofagów znakowanych radioaktywnie i rozdzielano bakterie od wirusów poprzez siłę grawitacji w trakcie silnego wirowania mieszaniny zawierającej pożywkę wzrostową wraz z zawieszonymi w niej mikroorganizmami.  Wirowanie powoduje, że cięższe bakterie trafiają do osadu (peletu) na dnie probówki, natomiast lżejsze fagi i ich fragmenty pozostają w górnej warstwie zwanej nadsączem bądź supernatantem. Rozdział zainfekowanych bakterii i wirusów zawierających otoczki białkowe znakowane radioaktywną siarką wykazał, że białka nie stanowią materiału genetycznego wnikającego do komórek bakterii gdyż większość radioaktywnego znacznika po wirowaniu probówek znajdowano w nadsączu zawierającym wirusy. Radioaktywny DNA, po zwirowaniu drugiej z probówek, zidentyfikowano natomiast w osadzie zawierającym zainfekowane bakterie. Na podstawie uzyskanych wyników eksperymentatorzy wywnioskowali, że DNA pełni istotną rolę w mechanizmie infekowania bakterii, jest on wstrzykiwany do wnętrza komórek i stanowi materiał dziedziczny niezbędny do zreplikowania bakteriofagów wewnątrz organizmów bakteryjnych, podczas gdy białkowa otoczka bakteriofaga pozostaje poza infekowaną komórką, a białka tym samym nie pełnią funkcji materiału genetycznego. To był przełom, na który świat nauki czekał od czasu odkrycia nukleiny przez Friedricha Mieschera blisko 100 lat wcześniej.

Równocześnie z rozwojem badań w obszarze genetyki biochemicy głowili się nad tym, w jaki sposób można połączyć właściwości genów z właściwościami znanych wówczas cząsteczek biologicznych. Zanim Hershey i Chase wykazali rolę DNA w przekazywaniu informacji genetycznej inny naukowiec, Archibald Garrod, na podstawie wyników uzyskanych podczas badania przyczyn występowania alkaptonurii wydedukował, że funkcją genu jest syntetyzowanie białek. Garrod rozpoczął badania w 1896 roku i niedługo po ponownym ożywieniu prac Grzegorza Mendla zauważył, że alkaptonuria jest dziedziczona w sposób odpowiadający wzorowi zaproponowanemu przez mnicha. Jak zobaczymy za chwilę, angielski lekarz dokonał podwójnego odkrycia: zidentyfikował przyczynę pierwszej znanej nauce choroby genetycznej i przy okazji tego niebanalnego odkrycia potwierdził istnienie dogmatu trwającego po dziś, który mówi o tym, że informacja na temat budowy białek jest zapisana w genach. Dziś wiadomo, że alkaptonuria jest rzadką chorobą związaną z defektem metabolicznym, polegającym na braku aktywności enzymatycznej białka kluczowego dla biochemicznych przemian aminokwasów aromatycznych: tyrozyny i fenyloalaniny. Garrod zauważył, że alkaptonuria jest chorobą monogenetyczną powodowaną przez gen recesywny, a nie powstającą  w wyniku infekcji nieznanym mikroorganizmem. Badacz określił chorobę jako „wrodzoną wadę metaboliczną”. Charakterystyczną cechą obserwowaną u pacjentów dotkniętych tą chorobą jest ciemnienie moczu powodowane obecnością kwasu homogentyzynowego, będącego produktem pośrednim metabolizmu aminokwasów. U osób zdrowych związek ten podlega przemianom biochemicznym katalizowanym przez enzym dioksygenazę kwasu homogentyzynowego, brak tego białka u osób chorych blokuje natomiast szlak metaboliczny, co skutkuje akumulacją kwasu homogentyzynowego w moczu. Choć mechanizm molekularny wywołujący alkaptonurię opisany został dopiero w 1958 roku, a gen HGD zawierający informację niezbędną do biosyntezy   dioksygenazy kwasu homogentyzynowego zidentyfikowano w roku 1995, to jednak spostrzeżenia Archibalda Garroda poczynione na początku XX wieku sugerowały już wtedy sposób, w jaki geny oraz ich mutacje mogą wpływać na biologię człowieka. To i wiele podobnych odkryć otworzyło nowe perspektywy dla medycyny i doprowadziło do zmiany postrzegania chorób przez człowieka. Choroby to problemy techniczne, a każdą wadę o naturze technicznej da się przecież rozwiązać, wymaga to jedynie znalezienia prawidłowego sposobu jej naprawy. Patrząc z perspektywy czasu odkrycie Garralda niosło jeszcze jedną niebywale istotną implikację dla współczesnej medycyny. Choroby metaboliczne
o podłożu genetycznym trudno jest wyleczyć na poziomie mutacji genetycznej, można to jednak zrobić w sposób pośredni, niejako obchodząc system, poprzez dostarczenie do organizmu pacjenta odpowiedniego białka, zastępującego to, które jest wadliwe.  Przykładowo pacjenci chorzy na hemofilię mogą otrzymywać enzym odpowiedzialny za krzepnięcie krwi w sytuacji gdy ich organizm nie potrafi go samodzielnie syntetyzować.

Hipotezę Garroda, mówiącą o tym, że geny kodują białka, potwierdzili w 1941 roku George Beadle (uczeń T. H. Morgana) oraz Edward Tatum przeprowadzając eksperymenty na pleśniaku Neurospora crassa należącym do gromady workowców (Ascomycota). Praca Garroda pozostała niezauważona przez współczesnych i dopiero wyniki badań pokazujące prosty związek między enzymami metabolicznymi i genami odpowiedzialnymi za ich syntezę rzuciły nowe światło na jego wcześniejsze osiągnięcia. Wyniki badań Beadle’a i Tatuma były kluczowe dla rozwoju nauk biomedycznych, gdyż doprowadziły do odkrycia zasady „jeden gen, jeden enzym”, która zakłada, że każdy z genów zawiera zakodowaną informację na temat syntezy pojedynczego białka – obecnie wiemy, że ta idea jest ogólnie rzecz biorąc nie do końca prawidłowa: geny mogą kodować białka nieenzymatyczne, jeden gen może kodować więcej niż jedno białko i może podlegać tzw. alternatywnemu składaniu nazywanemu splicingiem, gen może być też wyrażany w formie niekodującego RNA istotnego w potranskrypcyjnej regulacji ekspresji innych genów. Praca dwójki genetyków sprowadzała się do uzyskania serii mutantów metabolicznych Neurospora niezdolnych do wzrostu na pożywce pozbawionej wybranych aminokwasów – w tym celu spory były poddawane napromieniowaniu indukującemu mutacje w materiale genetycznym. Mutanty poddawano następnie kolejnym eksperymentom. Przykładowo grzyby w pożywce zubożonej w argininę nie rozwijały się prawidłowo, brak aminokwasu wiązał się bowiem z brakiem możliwości syntezy niezbędnych składników białkowych komórki. Naukowcy doszli do wniosku, że w mutantach uszkodzony był gen kodujący ważny enzym w szlaku metabolicznym prowadzącym do syntezy aminokwasu. Dopiero dostarczenie argininy do pożywki ratowało pleśniaka przed śmiercią.

W dużej mierze prace Garroda, Tatuma i Beadle’a przyczyniły się do tego, że obecnie możliwe są skuteczne terapie rzadkich chorób  metabolicznych o podłożu genetycznym. Przykładowo pacjenci z chorobą Pompego wykazują niedobór alfa-glukozydazy – enzymu rozkładającego glikogen w kwaśnym środowisku lizosomu. W przypadku niedoboru enzymu glikogen podlega akumulacji w tkankach, a w szczególności w mięśniach, w tym w mięśniu sercowym doprowadzając do ciężkiej miopatii metabolicznej. Enzymatyczna terapia zastępcza dostarcza do komórek brakujący enzym i stosowana jest obecnie w leczeniu pacjentów cierpiących z powodu choroby Pompego. Inna choroba metaboliczna, zwana chorobą Fabry’ego, jest wywoływana niedoborem enzymu  alfa-galaktozydazy A. W prawidłowo działających komórkach enzym ten rozkłada substancję tłuszczową zwaną globotriaozyloceramidem (Gb3). W przypadku braku tego enzymu Gb3 oraz jego pochodna gloobotriaozylsfingozyna (LysoGb3) podlegają akumulacji w lizosomach praktycznie wszystkich typów komórek organizmu prowadząc do choroby wieloukładowej z najpoważniejszymi skutkami klinicznymi obserwowanymi w sercu, nerkach i ośrodkowym układzie nerwowym. Terapia enzymatyczna pozwala dziś leczyć pacjentów z chorobą Fabry’ego.

Trzeba przyznać, że rozwój nauk biomedycznych w pierwszej połowie XX wieku był imponujący. Już na początku dwudziestego stulecia, w 1906 roku, William Bateson w trakcie konferencji naukowej poświęconej „hybrydyzacji i udoskonalaniu roślin” wystąpił z propozycją, aby dział zajmujący się zrozumieniem zmienności oraz dziedziczenia określić mianem genetyki. Propozycja została przyjęta w środowisku biologów, a kilka lat później, w celu unifikacji pojęć genetycznych, botanik Wilhelm Johanssen wprowadził pojęcia takie jak: gen, allel, fenotyp oraz genotyp. Już w latach 30-tych XX wieku, krótko po odkryciu przez Phoebusa Levene rybozy (rok 1909) i deoksyrybozy (1929), zaobserwowano różnice właściwości charakterystycznych dla DNA i RNA, jednak do momentu przedstawienia molekularnego modelu budowy DNA przyszło nauce poczekać aż do roku 1953. Olbrzymi wkład intelektualny w obszarze badań strukturalnych DNA należał do Maurice’a Willkinsa, który podczas prac w King’s College w Londynie, prowadził obserwacje kwasów nukleinowych w świetle spolaryzowanym i zauważył, że mają one strukturę równolegle ułożonych cząsteczek. Wyniki Willkinsa, a w szczególności pierwszy, otrzymany przez niego we współpracy z Raymondem Goslingiem, wzór rozpraszania promieni X na kryształach DNA, zainteresowały Jamesa Watsona do tego stopnia, że zdecydował się dołączyć do badań nad strukturą DNA. Ten sam temat wzbudził również ciekawość u badaczki Rosalind Franklin, która miała już w tym czasie spore doświadczenie w dziedzinie technik dyfraktometrycznych. Franklin w 1951 roku zaproponowała pierwszy model struktury DNA w postaci helikalnej zbudowanej z dwóch lub trzech nici. Z pracami duetu Watson-Crick, który ostatecznie rozwiązał zagadkę budowy DNA, związana jest bardzo ciekawa anegdota: szef ich laboratorium w Cambridge, Laurence Bragg, początkowo zabraniał im pracy nad molekularnym modelem DNA, gdyż w jego rozumieniu nietaktem było wchodzenie na poletko badawcze zarezerwowane już wcześniej przez badaczy z King’s College w Londynie. James Watson w laboratorium Bragga miał zajmować się tematyką dotyczącą wirusa mozaiki tytoniowej, a celem prac Francisa Cricka była najogólniej rzecz biorąc budowa białek. Młodzi i niepokorni badacze przyjęli ze skruszonymi minami zakaz poczyniony przez swojego szefa, jednak nie przeszkodziło im to w potajemnym kontynuowaniu swoich dociekań nad strukturą DNA.
W dostrzeżeniu eleganckiej prostoty budowy DNA pomogły im prace Rosalind Franklin oraz obserwacje amerykańskiego badacza Erwina Chargaffa, który odkrył, że cztery zasady azotowe wchodzące w skład kwasu nukleinowego zawsze występują w DNA w takim samym stosunku ilościowym. Na podstawie prac eksperymentalnych Chargaffa Watson i Crick wydedukowali, że zasady azotowe tworzą pary w DNA: adenina tworzy parę z tyminą, guanina paruje się z cytozyną. O przełomowym opisie struktury molekularnej DNA dwudziestokilkuletni wówczas Watson i niewiele od niego starszy Crick poinformowali najpierw swój mikroświatek naukowy 28 lutego 1953 roku podczas najzwyklejszego lunchu w pubie Eagle w Cambridge.  Publikacja wyników ich prac pojawiła się natomiast na łamach magazynu Nature 25 kwietnia 1953 roku równocześnie z doniesieniami Wilkinsa, Franklin i Goslinga – rozpoczęła się tym samym nowa era biologii molekularnej. Francis Crick, James Watson o Maurice Wilkins za swoje odkrycia otrzymali w 1962 roku Nagrodę Nobla. W tym odznaczeniu pominięta została Rosalind Franklin, która zmarła cztery lata wcześniej, w wieku zaledwie 37 lat, z powodu raka jajnika, po dwóch bezskutecznych operacjach mających powstrzymać rozwój choroby. Rosalind Franklin przyjaźniła się z Francisem Crickiem i jego żoną Odile, którzy byli dla niej mocnym wsparciem szczególnie w ostatnim okresie jej życia. Badaczka zmarła w ich domu, w Cambridge, gdzie przechodziła rekonwalescencję po zabiegu chirurgicznym.

 W wyścigu o opisanie struktury DNA brał również udział uzdolniony amerykański chemik Linus Pauling, który miał już w tym czasie spore osiągnięcia na polu dotyczącym struktury białek. Zaproponował nawet w swój, nietrafiony, jak się później okazało, trójniciowy model strukturalny – pech Paulinga polegał na tym, że zbyt mocno udział się politycznie i został oskarżony w USA o sympatie komunistyczne, co doprowadziło do jego oskarżenia oraz do zatrzymania paszportu, uniemożliwiając tym samym podróż badacza do Cambridge i zobaczenie obrazów uzyskanych przez Franklin. Choć Pauling przegrał tym razem rywalizację o Nobla, to nic nie stanęło mu już na drodze, aby uzyskać to wybitne odznaczenie jeszcze dwukrotnie.  

Prostota budowy formy B-DNA (znane są również inne, jak choćby A i Z) była zaskakująca, a jej chemiczne podstawy od samego początku odkrycia dały jasny sygnał, że niebawem zaistnieją możliwości eksperymentalnego modyfikowania sekwencji i struktury. Podwójna helisa DNA ma szerokość dwóch nanometrów, jest prawoskrętna, na jeden skręt przypada 10,5 pary zasad azotowych, co przekłada się na długość 3,4 nanometra, w jej strukturze można wyróżnić tak zwany mały i duży rowek. Cząsteczkę DNA często obrazuje się w formie drabinki, jednak znaczenie lepiej budowę kwasu nukleinowego opisuje analogia do stosu monet, ponieważ pary zasad pozostają w ścisłym kontakcie przez oddziaływania warstwowe, które stabilizują dwuniciową helisę. Końce DNA wykazują polaryzację, na każdym z końców 5’ nić posiada fosforan, natomiast na końcu 3’ zlokalizowana jest grupa hydroksylowa. DNA jest polimerem, zbudowanym z ukierunkowanego rusztowania cukrowo-fosforanowego, w którym do każdego cukru pentozowego w pozycji 1’ przyłączona jest zasada azotowa. Cukry w tym rusztowaniu połączone są za pośrednictwem fosforanu umieszczonego pomiędzy pozycją 5’ jednego cukru i 3’ następnego tworząc wiązanie nazywane 3’5’-fosfodiestrowym. Jednostką powtarzającą się w DNA jest tzw. nukleotyd, który jest zbudowany z cukru, zasady azotowej i fosforanu. W przeciwnie zorientowanych łańcuchach DNA poszczególne zasady azotowe tworzą ze sobą pary, które połączone są termodynamicznie stabilnymi wiązaniami wodorowymi, przy czym adenina i tymina łączą się za pośrednictwem dwóch takich wiązań, natomiast cytozyna i guanina parują za pośrednictwem trzech wiązań wodorowych.

Model strukturalny DNA sugerował w pewien sposób mechanizm replikacji, czyli powielania DNA w jądrze komórkowym. Główny problem stanowiła jednak sama topologia cząsteczki, a jej rozplatanie w komórce wydawało się dla wielu badaczy, w tym Maxa Delbrucka, wręcz niewykonalne. W rozwikłaniu podstaw procesu replikacji przełomowym okazał się eksperyment, w którym Matt Meselson (były student Paulinga) i Frank Stahl dowiedli semikonserwatywnego podłoża mechanizmu kopiowania DNA. Badacze wykorzystali technikę wirowania różnicowego w gradiencie stężenia chlorku cezu – technika ta pozwalała na uporządkowanie cząsteczek minimalnie różniących się ciężarem pod wpływem siły odśrodkowej, która powoduje, że po wirowaniu cząsteczki cięższe znajdują się bliżej dna probówki niż cząsteczki z natury lżejsze, wędrujące w gradiencie ku górze. Najpierw hodowali bakterie na pożywce zawierającej ciężki izotop azotu 15N, który podczas wzrostu bakterii wbudowywał się do obu nici DNA – atomy azotu są obecne w purynach i pirymidynach wchodzących w skład podwójnej helisy. W kolejnym etapie eksperymentu Meselson i Stahl pobierali część kultury bakteryjnej wzrastającej w pożywce z 15N i przenosili ją do pożywki zawierającej nieradioaktywny azot 14N, aby bakterie w kolejnej rundzie replikacji wykorzystywały ten lekki azot do syntezy nowych nici DNA. Zastosowana procedura potwierdziła model semikonserwatywny zakładający, że podczas replikacji kwas nukleinowy jest rozplatany, a jedna z nici DNA, tzw. nić matrycowa, stanowi wzór do syntezy drugiej nici de novo. W probówkach po zwirowaniu obserwowano lokalizację DNA na różnych poziomach: DNA zawierający tylko ciężki azot znajdował się na dnie probówki, DNA będący hybrydą nici lekkich i ciężkich po pierwszej rundzie replikacji lokalizowany był nieco wyżej, natomiast lekkie łańcuchy DNA występowały najbliżej otworu probówki, a ich ilość zwiększała się po każdej rundzie kopiowania materiału genetycznego. Problem rozplatania nici DNA zrozumiano nieco później przy odkryciu tzw. helikaz i topoizomeraz – białek, które uczestniczą w replikacji. Helikazy rozplatają DNA w tym procesie, topoizomerazy niwelują natomiast napięcia torsyjne powstające podczas rozplatania i prowadzą do relaksacji DNA. Wyjaśnienie mechanizmu replikacji stanowiło kolejny przełom w odkrywaniu zasad rządzących przekazywaniem informacji genetycznej w komórkach i doprowadziło ostatecznie do wynalezienia wielu leków. Niektóre terapie stosowane w leczeniu nowotworów polegają na wykorzystaniu inhibitorów topoizomerazy w charakterze cytostatyków: w taki sposób działają topotekan i irynotekan. Arabinozyd cytydyny czyli cytarabina oraz mitomycyna również zatrzymują podziały komórek nowotworowych poprzez blokowanie syntezy DNA.

Szczegółami mechanizmu replikacji DNA interesowano się także w pracowni Arthura Kornberga z Washington University w St. Luis. Kornberg stał się ojcem enzymologii DNA po tym, jak dokonał odkrycia polimerazy DNA – enzymu łączącego składniki DNA i tworzącego wiązania 3’5’-fosfodiestrowe wchodzące w skład szkieletu cząsteczki życia. Odkrycia Kornberga zostały docenione natychmiast, a badacz został uhonorowany Nagrodą Nobla w dziedzinie fizjologii i medycyny w roku 1959. Jego odkrycia przyczyniły się również do opracowania technik biologii molekularnej, które są rutynowo wykorzystywane w laboratoriach po dziś – bez wkładu Kornberga trudno wyobrazić sobie opracowanie metody reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) czy technologii enzymatycznego sekwencjonowania DNA.

Od momentu pierwszych odkryć  dotyczących mechanizmu replikacji biologowie poczynili wiele starań zmierzających do szczegółowego opisania tego fenomenu. Obecnie znanych jest przynajmniej 13 różnych polimeraz DNA, które są wyspecjalizowane w wybranych aspektach syntezy i naprawy DNA. Oprócz białek o aktywności helikazy i topoizomerazy odkryto dodatkowe elementy maszynerii replikacyjnej takie jak: prymaza, która jest odpowiedzialna za syntezę krótkich fragmentów kwasu nukleinowego na początku replikacji, białko SSB stabilizujące strukturę DNA w tym procesie, ligaza, która łączy zreplikowane fragmenty DNA. Zwróć uwagę, że DNA ma strukturę antyrównoległą, natomiast polimeraza DNA ma zdolność syntezy tylko w jednym kierunku od końca 5’ do końca 3’. W obecnym modelu replikacji jedną z nici określa się mianem nici prowadzącej, druga z nici nazywana jest nicią opóźnioną. Antyrównoległość helisy wymusza istotne różnice w procesie syntezy nowego DNA na każdej z tych nici. Replikacja na nici prowadzącej przebiega w sposób ciągły, natomiast druga nić kopiowana jest krótkimi fragmentami, które od nazwiska japońskiego odkrywcy tego skokowego mechanizmu syntezy zostały nazwane fragmentami Okazaki. Co ciekawe, liniowe końce chromosomów przy każdej rundzie replikacji ulegają niewielkiemu skróceniu, które jest wynikiem różnic w syntezie nici prowadzącej i opóźnionej. Takie skracanie materiału genetycznego prowadzi ostatecznie do ograniczenia możliwości replikacji starzejących się komórek. W 1962 roku Leonard Hyflick zaobserwował, że komórka przechodzi jedynie ograniczoną ilość podziałów, po czym traci tę zdolność – punkt, w którym komórki tracą możliwość dalszych podziałów nazywany jest limitem Hyflicka. Obecnie uważa się, że zatrzymanie podziałów związane jest bezpośrednio ze skracaniem się chromosomów w trakcie kolejnych rund replikacji i zabezpiecza organizm przed niebezpieczną utratą materiału genetycznego. W trakcie ewolucji komórki wypracowały jednak mechanizm przeciwdziałania skracaniu się chromosomów poprzez dodawanie do ich końców  tzw. telomerów, które są zbudowane z wielu powtórzeń stałej sekwencji kilku nukleotydów – sekwencja ta została zakonserwowana ewolucyjnie od drożdży, poprzez orzęski, po rośliny wyższe i ssaki. Telomery człowieka są dobudowywane przez kompleks rybonukleoproteinowy (składa się z białka oraz kwasu rybonukleinowego) nazywany telomerazą  i składają się z kilku tysięcy powtórzeń sekwencji GGTTAG. Telomeraza znalazła się w szczególnym polu uwagi biologów molekularnych z racji tego, że zaburzenia jej funkcjonowania mają swoje implikacje w procesach starzenia oraz w nowotworzeniu. Większość somatycznych komórek człowieka wytwarza zbyt mało telomerazy, aby utrzymać prawidłową długość telomerów po wielu cyklach replikacji chromosomów, a utrata telomerów może doprowadzać do niebezpiecznej fuzji końców chromosomów, wzmaga procesy związane ze zmiennością rekombinacyjną i prowadzi do uruchomienia apoptozy czyli programowanej śmierci komórki. Z kolei komórki nowotworowe charakteryzują się wzmożoną aktywnością telomerazy, co w połączeniu z deregulacją cyklu komórkowego, pozwala im na niekontrolowaną proliferację.

Podczas starzenia się organizmu dochodzi w komórkach do zmian struktury oraz do zaburzeń funkcji telomerów człowieka, co ma z kolei istotne implikacje dla stanu zdrowia, a właściwie do jego osłabienia. Niestabilność genomu spowodowana skracaniem się sekwencji telomerowych, z których w każdej rundzie replikacji znika około 50 – 150 pz, przyczynia się częstszego występowania nowotworów. Dyskeratoza wrodzona recesywna, związana z chromosomem X oraz dyskeratoza wrodzona, dominująca, autosomalna to znane medycynie zespoły przedwczesnego starzenia mające podłoże genetyczne. Zmniejszona aktywność telomerazy u pacjentów dotkniętych tymi chorobami wywołuje uszkodzenia wielonarządowe, takie jak, marskość wątroby, fibroza płuc, hipogonadyzm, postępująca niewydolność szpiku kostnego, a dodatkowo objawia się nadmiernym rogowaceniem
i zanikiem skóry dłoni i stóp, zaburzeniami budowy płytek paznokciowych oraz przebarwieniami błon śluzowych i leukoplakią. Dyskeratoza jest bardzo rzadką chorobą, występującą u jednej osoby na milion, manifestującą się zazwyczaj przed 50-tym rokiem życia. Jak najpełniejsze zrozumienie roli telomerazy w patogenezie molekularnej chorób ma  zatem zasadnicze znaczenie dla diagnostyki, poradnictwa genetycznego oraz dla postępowania z osobami chorymi. Na całym świecie prowadzone są obecnie badania kliniczne będące w różnych fazach zaawansowania prac zmierzających do stworzenia nowoczesnych leków działających w mechanizmach molekularnych związanych z funkcjonowaniem ludzkiej telomerazy. Na stronie internetowej clinicaltrials.gov, pod egidą National Institute of Health, można znaleźć informacje na temat ponad 60 badań klinicznych w tym obszarze, a spektrum wskazań i obszarów terapeutycznych jest imponujące. Włóknienie płuc, ostra białaczka mieloblastyczna, choroba Alzhmimera, czerniak, rak płuca, rak pęcherza to tylko wybrane przykłady chorób, które niebawem będą leczone przy użyciu nowych terapii, których mechanizmy działania są oparte na wiedzy dotyczącej funkcjonowania telomerazy. Przykładem jest telomelizyna, adenowirus onkolityczny posiadający zdolność do replikacji jedynie w komórkach nowotworowych i prowadzący do ich lizy. Selektywność działania powoduje, że leczenie wirusami onkolitycznymi jest korzystniejsze niż inne metody stosowane w kuracji onkologicznej, a zwłaszcza mało selektywna konwencjonalna terapia przeciwnowotworowa. Telomelizyna, opracowana przez firmę Oncolys BioPharma, jest onkolitycznym adenowirusem serotypu 5 ze zmodyfikowanym materiałem genetycznym, który selektywnie replikuje się w komórkach nowotworowych poprzez wprowadzenie do wirusa sekwencji promotora genu ludzkiej odwrotnej transkryptazy wchodzącej w skład telomerazy (hTERT). Podczas aktywacji promotora (hTERT) cały aparat komórkowy zmuszony jest do syntezy przede wszystkim białek wirusowych, co prowadzi do onkolitycznej śmierci komórek. Adenowirus onkolityczny ma duży potencjał w immunoterapii raka, ponieważ jego replikacja jest wysoce immunogenna, a onkoliza indukowana przez taki wirus uwalnia antygen nowotworowy i dostarcza układowi odpornościowemu stymulujących sygnałów o niebezpieczeństwie. Wiedza na temat funkcjonowania ludzkiej telomerazy znajduje również zastosowanie
w opracowywaniu nowatorskich metod diagnostyki onkologicznej. OBP-401 lub TelomeScan to genetycznie zmodyfikowany adenowirus typu 5 do wykrywania komórek nowotworowych. TelomeScan ma sekwencję promotora ludzkiego genu odwrotnej transkryptazy telomerazy (hTERT)
w regionie powyżej genu wirusa E1, który jest odpowiedzialny za replikację adenowirusa, oraz gen zielonego białka fluorescencyjnego (GFP) w regionie E3 pod kontrolą promotora cytomegalowirusa. hTERT jest krytycznym składnikiem białkowym kompleksu enzymatycznego telomerazy, a jego ekspresja jest normalnie ograniczona w komórkach linii zarodkowej lub kilku komórkach macierzystych, w tym hematopoetycznych komórkach macierzystych. Komórki rakowe mają zasadniczo unieśmiertelniony charakter i wykazują silną aktywność telomerazy. Zatem OBP-401 może replikować się tylko w komórkach wykazujących aktywność telomerazy, takich jak komórki rakowe, poprzez zależną od aktywności promotora hTERT ekspresję genu E1/E2, ale nie w normalnych komórkach ujemnych pod względem aktywności telomerazy. Wraz ze wzrostem replikacji wirusa, jednocześnie wyrażany GFP gromadzi się w komórkach hTERT-dodatnich. Wykorzystując OBP-401 ex vivo, można wykryć żywe krążące komórki nowotworowe (CTC) we krwi pacjentów z rakiem z wysoką czułością i swoistością. Wykrywanie CTC byłoby w stanie zaoferować narzędzie do wczesnego wykrywania raka, monitorowania skuteczności terapeutycznej, monitorowania nawrotów guza i doboru odpowiedniej terapii dla pacjentów. 

Już na początku XX wieku, za sprawą odkryć Franza Hofmeistera i Emila Fishera, wiadomym było, że białka są zbudowane z aminokwasów ułożonych w sekwencję o charakterze liniowym. Pytaniem otwartym przez wiele lat pozostawała kwestia mechanizmu molekularnego, który pozwala na syntezę białek w komórkach. Odkrycie struktury DNA oraz wiedza o chemicznej jego naturze w połączeniu z informacją, że kwas nukleinowy jest polimerem o konkretnej sekwencji wyznaczanej poprzez nukleotydy zbliżała świat nauki do wyjaśnienia jednej z największych tajemnic dotyczących życia. Francis Crick szybko uzmysłowił sobie, że sekwencja DNA najprawdopodobniej zawiera zakodowaną informację na temat składu aminokwasowego białek syntetyzowanych w komórkach żywych organizmów, a kod genetyczny DNA stanowi zbiór reguł umożliwiających tłumaczenie języka genów na język białek. Już w roku 1954 fizyk George Gamow założył elitarne towarzystwo naukowe zrzeszające w swych szeregach samych geniuszy, którzy za cel postawili sobie pełną rekonstrukcję kodu genetycznego. Towarzystwo składało się z dwudziestu osób i zostało nazwane „RNA Tie Club” – każdy z członków nosił krawat symbolizujący jeden z aminokwasów białkowych. W tamtym czasie rola cząsteczek RNA w biochemicznej zagadce życia nie była jeszcze całkiem jasna. Przypuszczano, że informacja genetyczna zawarta w DNA ulega przepisywaniu na komplementarne sekwencje w postaci kwasu rybonukleinowego, RNA, stanowiącego swoisty łącznik pomiędzy DNA i ostatecznym produktem białkowym. Bardzo istotnym było odkrycie Mahlona Hoaglanda i Paula Zamecnika, którzy w 1958 roku wykazali eksperymentalnie, że aminokwasy znakowane radioaktywnie wiążą się z RNA przed ich włączeniem do łańcuchów białkowych, co sugerowało, że RNA jest w jakiś sposób zaangażowany w transfer aminokwasów. Dla badaczy była to niebywale istotna wskazówka, pokazująca że kluczowych odpowiedzi w obszarze pytań dotyczących syntezy białek należy faktycznie poszukiwać w świecie RNA. Już w roku 1961 dwójka badaczy, Francis Jacob i Jacques Monod, udowodniła poprzez prace zmierzające do charakterystyki funkcjonalnej operonu laktozowego bakterii Escherichia coli, że w DNA istnieją specyficzne włączniki transkrypcji, które prowadzą do uruchomienia syntezy cząsteczek RNA będących pośrednikami w produkcji białek. Eksperymenty przeprowadzane w laboratoriach badawczych Francis Jacoba, Jamesa Watsona, Sydneya Brennera, Charlesa Kurlanda i Francoisa Grosa wykazały ostatecznie rolę informacyjnej cząsteczki RNA (ang. mRNA – messanger RNA) w procesie biosyntezy białek, a niedługo potem biochemik Robert Holley zidentyfikował tajemniczą cząsteczkę RNA, która swoim kształtem przypominała liść koniczyny i uczestniczyła w tłumaczeniu informacji zawartej w mRNA na sekwencję aminokwasową białek. Cząsteczkę RNA odkrytą przez Holley’a nazwano transferowym albo transportującym RNA (ang. tRNA – transfer RNA) albowiem faktycznie brała ona udział w transferze aminokwasów białkowych niezbędnych do syntezy peptydów w procesie nazywanym translacją.

Literatura:

James D. Watson, DNA tajemnica życia, Wydawnictwo CiS, Wydawnictwo W.A.B., Warszawa 2005

Scroll to Top